Fucoidan chiết xuất từ Sargassum sp. và fucus vesiculosus

Làm giảm khả năng tồn tại của các tế bào ung thư phổi và các tế bào ung thư hắc tố da ác tính trong ống nghiệm và kích hoạt các tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) trên cơ thể của chuột thực nghiệm

Tóm tắt từ một bài báo khoa học Nhật Bản

Fucoidan được biết đến với các hoạt động sinh học rất quan trọng, bao gồm cả hoạt động chống khối u. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra ảnh hưởng của fucoidan thô được chiết xuất từ Sargassum sp. (MTA) và fucus vesiculosus (SIG) trên các tế bào ung thư phổi Lewis (LCC) và các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 (MC).

Trong vitro, các nghiên cứu được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích khả năng tồn tại của tế bào và cho thấy fucoidan SIG và MTA làm giảm đáng kể số lượng của các tế bào LCC và MC phát triển ở liều đáp ứng. Sự nhuộm các chất hóa học cho thấy được những sự thay đổi hình thái của các tế bào u hắc tố da B16 sau khi tiếp xúc với fucoidan. Những thay đổi quan sát được thể hiện fucoidan thô gây ra quá trình apoptosis.

Chuột đực C57BL/6JJCL đã bị tiêm màng bụng hàng ngày, hơn 4 ngày với một trong hai loại fucoidan SIG hoặc MTA (liều 50 mg / kg trọng lượng cơ thể). Mức độ hoạt hóa các tế bào diệt tự nhiên (NK) được tăng cường bởi fucoidan thô một cách phụ thuộc vào liều dùng theo sự hiển thị bởi chất đồng vị phóng xạ [51Cr ] được đánh dấu lên tế bào đích lympho chuột YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK) giải phóng ra.

Nghiên cứu này cung cấp sự thể hiện rõ rằng fucoidan thô tác động hiệu ứng hoạt tính sinh học vào mô hình tế bào ung thư phổi và da trong ống nghiệm và gây ra sự tăng cường kích hoạt các tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) trên cơ thể chuột thí nghiệm.

1. Giới thiệu

Fucoidan là một thuật ngữ được sử dụng cho một nhóm polysaccharides giàu sulfate fucose có chứa một lượng khác nhau của galactose, xylose và acid glucuronic. Fucoidan có thể được chiết xuất từ rong biển màu nâu như Sargassum sp. và fucus sp.

Gần đây, chức năng sinh học đa dạng của fucoidan đã được nghiên cứu chuyên sâu, các chức năng sinh học thường được cho của fucoidan bao gồm kháng u và điều hòa miễn dịch, chống virus, tác dụng chống huyết khối và chống đông máu.

Việc sử dụng các hợp chất tự nhiên hoạt tính sinh học cho ngăn chặn, phòng ngừa ung thư phát triển mạnh và đã được công nhận là một lĩnh vực tiềm năng rất lớn.

Fucoidan chiết xuất từ rong biển màu nâu đã được báo cáo để tăng cường hoạt động của tế bào miễn dịch NK (diệt tự nhiên), các tế bào này là một yếu tố quan trọng trong hoạt động chống ung thư.

Fucoidan đã được chứng minh gây ra giảm đáng kể số lượng tế bào ung thư phát triển và gây quá trình tự chết (apoptosis) đối với các dòng tế bào ung thư của người như ung thư lympho hạch HS-Sultan cũng như ung thư đại trực tràng các dòng HT-29 và HCT116 một cách phụ thuộc vào liều sử dụng.
Fucoidans có thể được chiết xuất và tinh chế từ rong biển thông qua quá trình nhiều bước khác nhau liên quan đến vật lý, hóa học và / hoặc xử lý enzym và các bước phân đoạn và tinh chế khác nhau [8].

Mặc dù các fucoidan được chiết xuất và làm biến đổi khác nhau, đều đã được báo cáo để phát huy hoạt tính sinh học, fucoidan thô đã được tìm thấy để phát huy tác dụng khả năng miễn dịch ở động vật mang khối u, dẫn đến hiệu quả chống khối u.

Fucoidan thô (hoặc có chứa fucose-sulfate polysaccharides) có thể được lấy thông qua axit loãng hoặc dung dịch nước chiết xuất bằng cách sử dụng các bước xử lý nhẹ hơn và ít gây biến đổi cấu trúc tối thiểu do đó duy trì các đặc tính tự nhiên của fucoidan.

Với kiến thức tốt nhất của chúng tôi, các tác động của fucoidan thô trên các tế bào ung thư phổi và da và các hoạt động phản ứng miễn dịch hiện vẫn chưa được xác định.

Vì vậy chúng tôi đã kiểm tra tác động của fucoidan thô được chiết xuất từ Sargassum sp. Và fucus vesiculosus trên sự gia tăng của các tế bào khối u ung thư phổi Lewis và ung thư hắc tố da ác tính B16 và đánh giá ảnh hưởng của nó đối với hoạt động đáp ứng miễn dịch.

Các mục tiêu chủ yếu của công việc hiện tại do đó để xác định xem liệu fucoidan thô có thể ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư da và phổi, và nếu như vậy, để mô tả các nhân tố góp phần đằng sau tác dụng này.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định rằng fucoidan thô gây cản trở tăng trưởng trong ống nghiệm của ung thư phổi Lewis và các tế bào khối u hắc tố da ác tính B16 bằng gây quá trình tự chết của các tế bào ung thư này (apoptosis).

Hơn nữa, các hoạt động chống khối u của fucoidan thô dường như được liên kết với một phản ứng miễn dịch, nâng cao, như mô tả bởi sự gia tăng trong hoạt động của tế bào miễn dịch diệt tự nhiên (NK) ở chuột.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Hóa chất

Hai mẫu fucoidan thô được sử dụng thông qua các công việc này.

Thứ nhất, fucoidan thô từ Sargassum sp. (MTA) được chiết xuất trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (xem mục 2.2) trong khi fucoidan thô từ F. vesiculosus (SIG) đã thu được thương mại (Công ty Sigma-Aldrich, Steinheim, Đức). Nguyên liệu rong khô Sargassum sp. đã được thu được từ Công ty TNHH Việt Delta (Hồ Chí Minh, Việt Nam).

Môi trường nuôi cấy tế bào của hãng MEM- eagle đã được mua từ Công ty Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức); huyết thanh thai bò (FBS) là từ các phòng thí nghiệm Flow (North Ryde, NSW, Úc), kháng sinh streptomycin, penicillin và Trypan Blue là từ Gibco (Canada). Hydrochloric acid (37%), d glucose và d-xylose được mua từ Merck (Darmstadt, Đức). Trifluoracetic acid (99%, TFA), axit tricloaxetic (99%, TCA), CaCl2, Na2SO4, BaCl2, arabinose, rhamnose, d-galactose và l-fucose từ Công ty Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức). Agarose D-2 thu được từ Hispanagar (Burgos, Tây Ban Nha). Tất cả các hóa chất được sử dụng là thuộc loại phân tích.

2.2. Chiết xuất fucoidan thô (MTA)

Rong biển chủng loại Sargassum sp. được giữ lại và rây qua một rây 500 micron.

Chiết xuất fucoidan thô đã được thực hiện bằng cách thêm 100 g rong biển đã rây vào bình 5 L có chứa 2 L 0,03 M HCl.

Hỗn hợp này sau đó được đặt trong bể ngâm 90° C (Julabo, Đức) với khuấy trộn liên tục ở  200 rpm trong 4 h. Huyền phù rong biển được lọc (giấy lọc Whatman, số 1) để có được một chiết xuất fucoidan.

Chiết xuất sau đó được kết tủa bằng cách sử dụng  ethanol (EtOH) 60%, và kết tủa được thu thập sau khi ly tâm (Máy ly tâm phòng thí nghiệm Sigma 4K15, VWR, Đan Mạch) ở 10.600 rpm trong 10 phút và kết quả thu được các viên được sấy đông khô.

Viên này là fucoidan thô và được gọi là MTA trong nghiên cứu này. Fucoidan thô (SIG) có nguồn gốc từ F. vesiculosus được thu thương mại từ Sigma-Aldrich Công ty (Steinheim, Đức).

Theo mô tả sản phẩm F. vesiculosus fucoidan đã được chuẩn bị thông qua các phương pháp chiết xuất được mô tả bởi Black.

2.3. Thủy phân bằng Acid

Bột thô fucoidan đã được sấy đông khô (MTA, 20 mg) và fucoidan thô (SIG, 20 mg) được thu thương mại đã được thủy phân một cách riêng biệt bằng cách sử dụng 2 M TFA (nồng độ cuối cùng) ở 121 ° C trong 2 giờ.

Các hỗn hợp thủy phân sau đó được sấy đông khô ở -57 ° C (Heto Lyolab 3000, Anh). Các bột khô được hòa tan lại trong nước cất gấp đôi và ly tâm ở 10.000 rpm trong 10 phút để thu thập các chất nổi trên mặt.

Các chất nổi trên mặt đã được lọc qua bộ lọc đầu ống tiêm 0.2 micron (SUN-SRI, Rockwood, TN) trước khi tiêm vào PAD-HPAEC để phân tích monosaccharide (xem mục 2.4).

2.4. Phân tích Fucoidan thành phần

Các chất trên mặt của mỗi mẫu fucoidan thô được axit thủy phân đã được phân tích cho các monosacarit và lượng sulfate.

Sự tách biệt và định lượng của monosaccharides được thực hiện bởi HPAEC, PAD phân tích bằng cách sử dụng một hệ thống ICS-3000 bao gồm máy bơm độ dốc (Kiểu DP-1), Máy dò điện hóa / sắc ký tháo rời (kiểu DC-1) và cực góp tự động (Dionex Corp, Sunnyvale, CA).

Sự ngăn cách đạt được bằng cách sử dụng một cột CarboPac ™ PA20 (3 mm x 150 mm) phân tích theo phương pháp mô tả bởi Arnous và Meyer [11]. Định lượng dữ liệu được thực hiện bằng cách sử dụng  phần mềm sắc ký  Chromeleon 6,8 SP4 Build 2361 (Dionex Corp, Sunnyvale, CA). G

iá trị tìm được của monosaccharides được đánh giá từ sự tồn tại song song, tức là, TFA thủy phân, lượng sấy đông khô, và HPAEC-PAD phân tích, các tiêu chuẩn của monosaccharide như được mô tả trước đây [11]. Phân tích lượng sulfate đã được thực hiện theo phương pháp mô tả bởi Jackson và McCandless [12].

2.5. Nuôi cấy tế bào và khảo nghiệm hoạt động chống khối u

Lewis phổi Ung thư biểu mô (LLC) và các tế bào khối u ác tính hắc tố da B16 (MC) được trồng trong môi trường MEM eagle bổ sung với 10% (v / v) bất hoạt FBS nhiệt, 1% streptomycin-penicillin và 1% của 200 mM l-glutamine.

Các tế bào được duy trì ở 37° C dưới 5% CO2. Mỗi phân ước (10 μl) của hỗn hợp tế bào MEM-FBS vừa được pha loãng với 90 μl 0,4% Trypan Blue cho việc đếm tế bào. Sự nuôi cấy sắp từng lớp đơn được thực hiện bằng cách thêm vào 100 μl hỗn hợp tế bào MEM-FBS trên đây trong 96 dãy giếng tấm với mật độ 3 × 104 tế bào. Tấm sau đó được ủ trong 24 giờ trong CO2 5% ở 37° C.

Sau đó môi trường đã được gỡ bỏ và thay thế bằng 100 μl môi trường MEM có chứa 2% FBS và nồng độ khác nhau (0,1-1,0 mg / ml) của Sargassum sp. Fucoidan thô (MTA) và fucoidan thô thương mại từ F. vesiculosus (SIG), và sau đó ủ trong 24 giờ. 20 μl dung dịch  MTT (5 mg / ml) đã được thêm vào các tấm nuôi cấy và sau đó chúng được ủ trong 4 giờ.

Cuối cùng, 100 μl dung dịch ổn định đã được thêm vào mỗi giếng và các tấm được ủ qua đêm ở 37°C dưới CO2 5%. Kết quả sự hấp thụ được đo bằng cách sử dụng một trình đọc Elisa ở 550-690 nm.

2.6. Khảo nghiệm độ hoạt động tế bào diệt tự nhiên (NK) dựa trên 51Chromium (51Cr) giải phóng ra

Chuột đực C57BL/6J (Clea Nhật Bản Inc., Tokyo, Nhật Bản) được cân trước khi tiêm màng bụng (IP) của mẫu fucoidan (50 mg / kg trọng lượng cơ thể) từ  Sargassum sp. (MTA) và fucoidan thương mại  từ F. vesiculosus (SIG) trong 0,1 ml nước muối sinh lý cho 4 ngày liên tiếp, nước muối sạch được sử dụng kiểm chứng, và Poly I: C được sử dụng xác thực.

3 con chuột được sử dụng mỗi lần nghiên cứu (n = 3). Lá lách chuột đã được gỡ bỏ và đánh trong môi trường huyền phù đầy đủ-1640 RPMI bổ sung với 100 U / ml của penicillin, 100 mg / ml của streptomycin, 2 mM của l-glutamine và 10% FBS.

Các tế bào lá lách đã được gieo trong 0,1 ml của môi trường đầy đủ này cho mỗi trong 96 giếng tấm chuẩn (Kiểu -V, Nalge, Nunc, Tokyo, Nhật Bản) ở mật độ của 1 × 107, 0,5 × 106, và 0,25 × 106 tế bào / ml. 51Cr (với natri cromat, 37 MBq / ml, Dupont, NEN Sản phẩm nghiên cứu, DE, USA) đã được sử dụng để đánh dấu cho các tế bào lympho chuột YAC-1 (dòng tế bào ung thư hạch lympho T chuột nhạy cảm với các tế bào NK)  bằng cách sử dụng một thời gian phơi sáng 1 giờ sau đó các tế bào đã được rửa sạch, đưa đến một mật độ 1 × 104/ml và được thêm vào  mỗi phân ước 0,1 ml vào các giếng. Tấm được ly tâm trong vòng 3 phút tại 800 rpm và nhiệt độ phòng, và sau đó ủ trong 4 h trong CO2 5% ở 37 ° C.

Tỷ lệ phần trăm giải phóng ra cụ thể được tính bằng cách sử dụng công thức: % 51Cr giải phóng ra cụ thể  = [(Giá trị đếm mỗi phút trung bình thử nghiệm giải phóng ra – Giá trị đếm mỗi phút trung bình tự phát) / (Giá trị đếm mỗi phút trung bình tổng cộng có thể giải phóng ra – Giá trị đếm mỗi phút trung bình tự phát)] × 100, dựa trên kết quả từ đo lường phóng xạ nổi trên mặt bằng cách sử dụng một máy đếm – γ (Gamma 5500B, Beckman Instruments Inc, CA, USA).

Các thí nghiệm tuân thủ hướng dẫn việc sử dụng các động vật thí nghiệm của các Viện Quốc gia về Y tế  và các quy định về thử nghiệm đã được phê duyệt của Ủy ban Sử dụng động vật của khoa khoa học y tế liên kết, trường Đại học Kitasato trước khi nghiên cứu bắt đầu.

2.7. Khảo nghiệm phát hiện Apoptosis

Cả hai MTA và SIG mẫu các fucoidan thô (nồng độ liều 0,8 mg / ml) và một mẫu đối chứng (không có fucoidan) đã được thử nghiệm trên khối u tế bào hắc tố ác tính B16 cho quá trình chết tế bào theo chương trình bởi phương pháp the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end-labeling (TUNEL) sử dụng bộ kit phát hiện apoptosis (Takara Bio Inc, Shiga, Nhật Bản).

Các tế bào khối u hác tố ác tính B16 đã được nuôi cấy trong một bản kính mang vật (Lab-Tek Chamber Slides, Nalge Nunc, Tokyo, Japan) mật độ trung bình  5 × 104 tế bào / ml, nghiên cứu với fucoidan cho 48 giờ và sau đó rửa sạch hai lần với PBS theo giải pháp bằng cách sửa chữa của các tế bào bằng cách sử dụng Paraformaldehyde 4% / PBS (pH 7.4).

Các tế bào trên các trang trình bày đã được khảo nghiệm theo các giao thức chuẩn được cung cấp trong bộ công cụ phát hiện apoptosis. Các tế bào tự hủy hoại được xem bằng cách sử dụng một kính hiển vi ánh sáng BX51 (Olympus Corp, Tokyo, Nhật Bản).

2.8. Thống kê phân tích

Bảng về dữ liệu và tính toán độ lệch trung bình và tiêu chuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng Excel (Microsoft Office 2010). Phân tích phương sai đã được thực hiện bằng cách sử dụng Minitab 15 (Minitab Inc. State College, PA, USA) bằng cách sử dụng một giá trị ý nghĩa của P ≤ 0,05.

Sản phẩm này không phải là thuốc và không có tác dụng thay thế thuốc chữa bệnh